Experimento de interação molecular: co-precipitação imunológica da cromatina ChIP

I. Introdução técnica

ChIP (Imunoco-precipitação de Cromatina) é uma técnica-chave para estudar as interações entre proteínas e DNA e é amplamente utilizada em áreas como localização de ligação de fatores de transcrição e análise de modificações epigenéticas.

II. Princípios técnicos

Usando a ligação específica de anticorpos antígenos, fragmentos de DNA ligados à proteína de destino são precipitados, refletindo verdadeiramente a proteína reguladora ligada à sequência de DNA.

III. Aplicações

Estudo de regulação de transcrição: Identificação de fatores de transcrição (por exemplo:p53, NF-κB).

Epigenética: Análise das modificações histológicas (p.ex.H3K27me3) no silêncio genético.

Mecanismo da doença: explorar padrões de ligação genômica para proteínas anormais, como o MYC, no câncer.

4) Pode ser comTecnologias como qpcr e seq.

Vantagens técnicas

O ChIP captura a ligação dinâmica de proteínas e DNA em estado real dentro da célula através de cruzamentos de formaldeído, evitando falsos negativos ou falsos positivos em experimentos in vitro, especialmente adequados para o estudo de eventos de ligação de curta duração, como fatores de transcrição.EAnticorpos específicos podemOutra vez.Fragmentos de DNA enriquecidos com precisão ligados a proteínas alvo, combinados com qPCR ou sequenciamento (ChIP-seq) para detecção de níveis de milhares de células (por exemplo, kits otimizados) com sensibilidade significativae com uma ampla aplicabilidade.

V. Tipo de amostra

Células frescas (células adesivas / células em suspensão), células congeladas, tecidos congelados, amostras de células pós-cruzadas.

Necessidades de amostras

amostras de células: cerca de 1 x 10 ^ 7 (pode ser um prato de 10 cm ou armazenado em uma sonda centrífuga na forma de células em suspensão, ou uma garrafa T75);

Congelação de tecidos: cerca de 70 mg;

Amostras de células reticuladas: processar as células com 1% de formaldeído reticulado.

Preparação da amostra e transporte

amostras de células vivas: a distância mais próxima pode ser mantida no prato / garrafa T75 / tubo centrífugo amostras de células frescas de temperatura normal express (chegada no dia seguinte mais tardar) transporte, a cidade pode ser entregue ou pessoalmente, a distância mais longa, pode congelar as células de gelo seco transporte -80 ℃;

amostra de tecido & amostra de células após cruzamento: -80 ° C congelamento para o transporte de gelo seco.

Reagentes necessários

Detectar com anticorpos de classe ChIP.

9. Ciclo experimental

1-2 semanas (sem sequenciamento)

X. Outros

Ao escolher a PCR RT, é necessário fornecer um local para o teste de seguimento.

Etapas específicas das células de reticulação de formaldeído: 1 adicionar a concentração final de formaldeído de 1% no prato celular, incubar a 37 ° C por 10 minutos; ② Lave as células duas vezes com DPBS gelado contendo [PMSF 1mM, inibidor de peptidase 1μg / ml e pepstatina A 1μg / ml]. ② Raspa as células em um DPBS gelado de 2 ml contendo inibidores de protease e transfira para um tubo centrífugo para congelamento.