Experimento de interação molecular: co-precipitação imunológica IP/CO-IP

I. Introdução técnica

Imunoprecipitação (IP) e Co-Imunoprecipitação (Co-IP) são técnicas essenciais para estudar a função e as interações das proteínas e são amplamente utilizadas nas áreas da biologia molecular e da biologia celular.

II. Princípios técnicos

IP através de anticorpos específicos com proteínas alvoA ligação é usada para isolar a proteína alvo (ou seja, o antígeno) usando anticorpos para detectar a expressão de uma determinada proteína.O CO-IP é baseado em IP para verificar a interação entre proteínas. Capturando uma proteína (proteína de isca) e detectando a proteína que interage com ela (proteína alvo),Assim,Enriquecimento específico das proteínas de destino estudadasEm seguida, estudar as proteínas que interagem com proteínas conhecidas no complexo.

III. Aplicações

• IP: Enriquecimento de proteínas de baixa abundância para espectroscopia de massa (IP-MS) e validação de especificidade de anticorpos.

• Co-IP: Estudo de complexos de fatores de transcrição, interações quinase-substrato e validação de interações conhecidas ou descoberta de novos parceiros de interação (por exemplo, complexos de vias de sinalização).

Vantagens técnicas

• IP: é altamente específico e depende da ligação única anticorpo-antígeno.

• Flexibilidade: o suporte é opcional em esferas magnéticas (fácil de operar e compatível com a automatização) ou aglutinantes (alta capacidade de ligação).

• CoIP: Autenticidade in vivo: Estuda as interações das proteínas no corpo em seu estado natural, que podem responder a interações mais reais das proteínas.

V. Tipo de amostra

Células frescas (células adesivas / células em suspensão), células congeladas, tecidos congelados, amostras de lisado.

Necessidades de amostras

• amostras de células: cerca de 5 x 10 ^ 6 (podem ser 2 pratos de 6 cm, ou armazenados na forma de células em suspensão em um tubo centrífugo, ou 2 garrafas T25);

• Tejido congelado: cerca de 40 mg; amostra de lito: concentração de proteína não inferior a 2 mg / mg e quantidade total de proteína não inferior a 3 mg.

Preparação da amostra e transporte

• amostras de células vivas: a distância mais próxima pode fornecer amostras frescas, será cultivado no prato / garrafa T25 / tubo centrífugo dentro de amostras de células frescas express temperatura normal (chegada no dia seguinte mais tardar) transporte, a cidade pode ser entregue ou pessoalmente, a distância mais longa, pode congelar as células de gelo seco transporte -80 ℃;

• amostra de tecido & amostra de crachado: -80 ° C congelado para o transporte de gelo seco.

Reagentes necessários

Detecção de anticorpos IB e IP

9. Ciclo experimental

1-2 semanas (sem espectro de massa)

X. Outros

Western Blot / Espectroscopia de Proteína