AminobilinaN-N-Desmetilase (E）Instruções do kit de teste de atividade

Método Micrométrico 100 tubo/48 Tipo

É necessário antes da determinação oficial 2-3 Uma amostra com maior diferença esperada para a previsãoDeterminação de significado:

CitocromaP450 Uma enzima é um grupo de sistemas enzimáticos que desempenham um papel importante no metabolismo de substâncias estrangeiras, especialmente drogas e venenos.E ComoP450um membro importante do sistema enzimático, equivalente aO CYP3A4 Subtipo, estreitamente associado à reação de desmetilação do medicamento.

Princípio de determinação:

E Catalisar a liberação de formaldeído de aminobilin, através Nash O teor de formaldeído pode ser calculado por cromatografiasair E Atividade.

Kit de teste de atividade de aminobilina-N-desmetilase P450

Composição:

Reagente 1: pó×1 garrafas,4℃Salvar. Pré-administração 100ml A água destilada é completamente dissolvida.

Reagente 3: pó×1 Tubo,4℃Proteção contra a luz. Inscrever-se antes da utilização 1ml Sem etanol, totalmente dissolvido. Reagente 4: pó×1Tubo,4℃Salvar. Inscrever-se antes da utilização 0,5 mlÁgua destilada, totalmente dissolvida.

Reagente 5: pó×1 garrafas, conservar a temperatura ambiente. Água destilada antes do uso 4 ml totalmente dissolvido.

Líquido padrão: líquido×1 garrafas,-20℃Salvar. Antes da administração 1,5 ml EP Tubo, Junte-se 10μl Liquido padrão, mais 990 μl Água destilada, misturada0.05 mmol / L solução padrão de jiaaldehid,4℃Salvar.

Os parâmetros de um produto específico dependem dos parâmetros da descrição do produto recebida

Instrumentos e suprimentos próprios:

Centrífuga comum, centrífuga de sobrevelocidade, panela de banho, pistola de pipeta ajustável, espectrofotômetro UV/Calibrador enzimático, traço de quartzo/96 Buracoplacas, água destilada, etanol e gelo.

Extração de líquido enzimático bruto：

1、Remover substâncias macromoleculares como núcleos celulares, mitocondrias e outros:Nome 0.5g Organização, Junte-se 1 ml Reagente 1, moído completamente no gelo,10 000g 4℃De longecoração 30 minutosRemova o líquido para o tubo centrífugo de supervelocidade.

2、Particulas grosseiras:4℃，100 000gCentrífuga. 60 minutosElimine o líquido.

3Eliminação de impurezas como hemoglobina: passos 2 Adicionado ao precipitado 1ml Reagente 1, dissolve completamente após a cobertura,100 000g Centrífuga 30 minutosAbandone.Liquido limpo.

4、partículas finais:Passos para 3 Adicionando o Reagente II 0.5 mlA cobertura é totalmente dissolvida por choque, isto é, líquido enzimático grosso, a ser testado. O líquido de teste precisa

utilização no mesmo dia.

E Operações de medição de atividade:

1. Espectrofotômetro/Preaquecimento do marcador enzimático 30 minAjustar o comprimento de onda para 412 nmA água destilada é zero.

2. O Reagente 2 é colocado 37℃Preaquecimento no banho 30 minutos。

3. Tubo de controle:取 1 filialEP Tubo, Junte-se 10μl líquido enzimático,170 μl Reagentes 2,10μl Reagentes 3,10μl Água destilada, misturada e colocada em 37℃

Isolamento do banho 30 minutosInscrever-se imediatamente 35 μl Reagente 5, misturado e colocado em banho de gelo 5 minutos；取sairJunte-se depois 35 μl Reagente 6. Temperatura ambiente após mistura.Estacionamento 5 minutosTemperatura ambiente 8000 rpm Centrífuga 5 minutos• Obter novosEP Tubo, Junte-se 100μl líquido limpo,100μl Reagente 7, após mistura 60℃Banho de água 10 minutosE depois pegue.sairResfriar com água fria. 5 minutosEm 412nmDeterminar a absorção de luz, comoAControle do tubo.

4. Tubo de medição:取 1 filialEP Tubo, Junte-se 10μl líquido enzimático,170 μl Reagentes 2,10μl Reagentes 3,10μl Reagente 4, depois de misturar 37℃

Isolamento do banho 30 minutosInscrever-se imediatamente 35 μl Reagente 5, misturado e colocado em banho de gelo 5 minutos；取sairJunte-se depois 35 μl Reagente 6. Temperatura ambiente após mistura.Estacionamento 5 minutosTemperatura ambiente 8000 rpm Centrífuga 5 minutos；取 1 Branco NovoEP Tubo, Junte-se 100μl líquido limpo,100μl Reagente 7, após mistura 60℃Águabanho 10 minutosE depois pegue.sairResfriar com água fria. 5 minutosEm 412nmDeterminar a absorção de luz, comoATubo de medição.

5. Tubo padrão:取 1 filialEP Tubo, Junte-se 100μl produtos padrão,100μl Reagente 7, após mistura 60℃Banho de água 10 minutosE depois pegue.sairCom frio.Refrigeração de água5 minutosEm412nm Determinar a absorção de luz, comoA tubo padrão.

NOTA: Cada amostra precisa ser controlada.

E Cálculo de atividade:

a.A fórmula de cálculo para medição com uma placa de quartzo em traços é a seguinte:

（1）Calculado pela concentração de proteína

Definição de unidade ativa:37℃Produção de proteína por miligrama por minuto 1nmol Formaldehida é 1 uma unidade enzimática.

E Atividade(nmol/min/mg) prot) =C Produtos padrão×V Produtos padrão×（A Tubo de medição -A Tubo de controle）÷A Tubo padrão×Múltiplo de diluição÷（Cpr× Vsemelhante)÷T

=45×（A Tubo de medição -A tubo de controle)÷A Tubo padrão÷Cpr。

（2）Calculado pela qualidade da amostra

Definição de unidade ativa:37℃Produzido por grama de tecido por minuto 1nmol Formaldehida é 1 uma unidade enzimática.

E Atividade(nmol / min / g) Pesado ) =C Produtos padrão× V Produtos padrão×（A Tubo de medição -A tubo de controle)÷A Tubo padrão×Múltiplo de diluição÷(V) Tipo

÷V Geral× W) ÷ T

=45×（A Tubo de medição -A tubo de controle)÷A Tubo padrão÷W。

C Produtos padrão:0.05 mmol / L = 50 μmol / L；V Produtos padrão:500μl = 0,0005 LMúltiplos de diluição:V contra-geral÷V líquido superior=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7；CPRConcentração de proteínas (em mg/ml）Necessita de medição adicional, recomendamos o uso da empresa BCAKit de teste de teor de proteína;Vamostra: adicionar o volume de líquido de enzima grossa,50 μl = 0,05 ml；VTotal da amostra: volume de líquido extraído,0,5 ml；TTempo de Reação Catalítica (min），30 minutos。

b.usar 96 A fórmula de cálculo para a medição da placa é a seguinte:

（1）Calculado pela concentração de proteína

Definição de unidade ativa:37℃Produção de proteína por miligrama por minuto 1nmol Formaldehida é 1 uma unidade enzimática.

E Atividade(nmol/min/mg) prot) =C Produtos padrão× V Produtos padrão×（A Tubo de medição -A Tubo de controle）÷A Tubo padrão×Múltiplo de diluição÷（Cpr× Vsemelhante)÷T

=45×（A Tubo de medição -A tubo de controle)÷A Tubo padrão÷CPR。

（2）Calculado pela qualidade da amostra

Definição de unidade ativa:37℃Produzido por grama de tecido por minuto 1nmol Formaldehida é 1 uma unidade enzimática.

E Atividade(nmol / min / g) Pesado) =C Produtos padrão× V Produtos padrão×（A Tubo de medição -A tubo de controle)÷A Tubo padrão×Múltiplo de diluição÷(V) Tipo÷VGeral× W) ÷ T

=45×（A Tubo de medição -A tubo de controle)÷A Tubo padrão÷W。

C Produtos padrão:0.05 mmol / L = 50 μmol / L；V Produtos padrão:500μl = 0,0005 LMúltiplos de diluição:V contra-geral÷V líquido superior=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7；CPRConcentração de proteínas (em mg/ml）Necessita de medição adicional, recomendamos o uso da empresa BCAKit de teste de teor de proteína;V amostra: adicionar o volume de líquido de enzima grossa,50 μl = 0,05 ml；V Total da amostra: volume de líquido extraído,0.5 ml；TTempo de Reação Catalítica (min），30 minutos。

Atenção:

1O líquido coarse deve ser concluído no mesmo dia, se necessário conservar, extrair o líquido coarse passos 3 Adicionado ao precipitado 0,5 ml 20%A glicerina, após a partilha,

-80℃conservação;

2O reagente 3 e o reagente 4 devem ser preparados antes da utilização, se não tiverem sido usados no mesmo dia,4℃Proteção contra a luz, disponível 1 Semana;

3O líquido coarse pode ser usado diretamente para medir a concentração de proteínas, recomendado BCA Determinação do conteúdo de proteínas.

Kit de teste de atividade de aminobilina-N-desmetilase P450