Su-N-desmetilase do mofo vermelho (ERND)Instruções do kit de teste de atividade

Método Micrométrico 100T/48S

É necessário antes da determinação oficial 2-3 Uma amostra com maior diferença esperada para a previsãoDeterminação de significado:

citocromo P450 Uma enzima é um conjunto de sistemas enzimáticos que se encontram principalmente no fígado, no metabolismo de substâncias estrangeiras, especialmente drogas e venenos.tem um papel importante. ERND emP450 O sistema enzimático é equivalente aO CYP2B Subtipo, estreitamente associado à desmetilação do metabolismo da droga. CYP2B PossuiO substrato catalítico forma metabólicos inativos e fáceis de excretar e tem efeito desintoxicante, também pode fazer com que certos medicamentosAtivação do metabolismo CYP2B.

Princípio de determinação:

ERNDCatalisar molde vermelho su liberar formaldeído, atravésNash para medir o teor de formaldeído ERND 活性。

Kit de teste de atividade de su-N-desmetilase de mofo vermelho Série P450

Composição:

Reagente 1: pó x 1 garrafas, 4℃ conservação. Pré-administração100ml Dissolver na água destilada.

Reagentes 3: pó x 1 tubo, 4℃ conservação. Pré-administração1 ml de água destilada, completamente dissolvido.Reagente 4: pó x 1 garrafas, 4℃ conservação. Pré-administração0,5 ml Água destilada, totalmente dissolvida.Reagente 5: pó x 1 garrafas, 4℃ conservação. Adicione água destilada antes da utilização.4,5 ml totalmente dissolvido.

Líquido padrão: líquido x 1 garrafas -20℃ conservação. Antes da administraçãoEP de 1,5 ml Tubo, Junte-se 10μlLiquido padrão, mais 990 μl de água destilada, misturada em 0,05 mmol/LSolução padrão de jialdehid, 4℃保存。

Os parâmetros de um produto específico dependem dos parâmetros da descrição do produto recebida

Instrumentos e suprimentos próprios:

Centrífuga comum, Centrífuga de sobrevelocidade, Pistola de pipeta ajustável, Espectrofotômetro visível/Calibrador enzimático, Trace de quartzo/96 Placa furada, destilaçãoÁgua e gelo.

Extração de líquido bruto:

1、Remover substâncias macromoleculares como núcleos celulares, mitocondrias e outros:Nome 0.5g Organização, Junte-se 1ml Reagente 1, moído completamente no gelo, 10 000g 4°C de distânciacoração 30min， Retire o líquido limpo e coloque-o em um tubo centrífugo de alta velocidade.

2、Particulas grosseiras:100 000g，4℃, centrifugação60min， Elimine o líquido.

3、Eliminação de impurezas como hemoglobina:Passos para 2 Adicionado ao precipitado 1mlReagente 1, dissolvido completamente após a cobertura, 100000gCentrífuga 30min， Abandonar

Liquido limpo.

4、partículas finais:Passos para 3 Adicionando o Reagente II 0.5ml， Solução de choque suficiente, ou seja, líquido enzimático bruto, a ser testado. O líquido deve ser usado no mesmo dia.

Operação de medição:

1. Espectrofotômetro/Preaquecimento do marcador enzimático 30 minutosAjustar o comprimento de onda para 412 nm， A água destilada é zero.

2. O Reagente 2 é colocado 37Aquecimento no banho de água30 minutos。

3. Tubo de controle:取 0,5 ml EP Tubo, Junte-se10μl Liquido enzimático bruto, 170 μl Reagente 2, 10 μl Reagente 3, 10 μl Água destilada, misturada e colocada em37℃Isolamento do banho 30 minutosInscrever-se imediatamente 35 μlReagente 5, misturado e colocado em banho de gelo 5 minutos; 取出Junte-se depois 35 μl Reagente VI, misturado a temperatura ambiente

Estacionamento 5 minutosTemperatura ambiente 8000 rpmCentrífuga 5min； Obter um novo EPTubo, Junte-se 100μl líquido, 100 μl Reagente 7, após mistura Banho de água de 60°C10min， E depois tira.Resfriar com água fria. 5 minutosEm 412nmDeterminar a absorção de luz, comoA controle.

4. Tubo de medição:取 0,5 ml EP Tubo, Junte-se10μl Liquido enzimático bruto, 170 μl Reagente 2, 10 μl Reagente 3, 10 μl Reagente 4, depois de misturar37℃

Isolamento do banho 30 minutosInscrever-se imediatamente 35 μlReagente 5, misturado e colocado em banho de gelo5 minutos; 取出Junte-se depois 35 μl Reagente VI, misturado a temperatura ambienteEstacionamento 5 metrosinTemperatura ambiente 8000 rpmCentrífuga 5 metrosem• Obter novos EPTubo, Junte-se 100 μl de líquido，100μl Reagente 7, após mistura 60℃ banho de água10min， E depois tira.Resfriar com água fria. 5 minutosEm 412nmDeterminar a absorção de luz, comoA tubulação de medição.

5. Tubo padrão:取 EP de 0,5 mlTubo, Junte-se 100μlProduto padrão, 100 μl Reagente 7, após mistura 60℃ banho de água10min， Em seguida, tirar,Use frio.

Refrigeração de água 5 minutosEm 412nm Determinar a absorção de luz, comoA tubo padrão.

NOTA: Cada amostra precisa ser controlada.

ERND Fórmula de cálculo de atividade:

a.A fórmula de cálculo para medição com uma placa de quartzo em traços é a seguinte:

(1).Calculado de acordo com a concentração de proteínas:

Definição de unidade ativa: 371 nmol por minuto por milímetro de proteínaFormaldehida é uma unidade enzimática.

ERND Atividade (nmol/min/mg)prot) = C Produto padrão x V Produtos padrão×(A) Tubo de medição - A Tubo de controle）÷A Tubo padrão x múltiplo de diluição÷(Cpr × V)

Tipo÷T

=45 vezes (A) Tubo de medição - A tubo de controle) ÷ A Tubo padrão ÷Cpr。

(2).Calculado de acordo com a qualidade da amostra:

Definição de unidade ativa: 371 nmol por minuto por grama de amostraFormaldehida é uma unidade enzimática.

ERND Atividade (nmol/min/g) Peso = C Produto padrão x V Produto padrão x (A) Tubo de medição - A tubo de controle) ÷ A Tubo padrão × múltiplo de diluição ÷ (W × V) ÷T

=45 vezes (A) Tubo de medição - A tubo de controle) ÷ A Tubo padrão÷W

O CProduto padrão: 0.05mmol/L = 50 μmol/L; O VProduto padrão: 100 μl = 1 x 10^-4 L; múltiplo de diluição: VAntitotal ÷V Liquido líquido = (50 + 850)

+50+50+175+175）÷500=2.7； Cpr: concentração de proteína em líquido bruto (mg/ml)Necessita de medição adicional, recomendamos o uso da empresaBCA

Kit de teste de teor de proteína; W: qualidade da amostra, g；V Amostra: adicionar o volume de líquido de enzima grossa, 10 μl = 0,01 ml; T: Tempo de Reação Catalítica(m)em），

30 minutos。

b.usar A fórmula de cálculo para a medição da placa de 96 buracos é a seguinte:

(1).Calculado de acordo com a concentração de proteínas:

Definição de unidade ativa: 371 nmol por minuto por milímetro de proteínaFormaldehida é uma unidade enzimática.

ERND Atividade (nmol/min/mg)prot) = C Produto padrão x VProdutos padrão×(A) Tubo de medição - A Tubo de controle）÷A Tubo padrão x múltiplo de diluição÷(Cpr × V)

Tipo÷T

=45 vezes (A) Tubo de medição - A tubo de controle) ÷ A Tubo padrão ÷Cpr。

(2).Calculado de acordo com a qualidade da amostra:

Definição de unidade ativa: 371 nmol por minuto por grama de amostraFormaldehida é uma unidade enzimática.

ERND Atividade (nmol/min/g) Peso = C Produto padrão x V Produto padrão x (A) Tubo de medição - A tubo de controle) ÷ A Tubo padrão × múltiplo de diluição ÷ (W × V) ÷T

=45 vezes (A) Tubo de medição - A tubo de controle) ÷ A Tubo padrão÷W

O CProduto padrão: 0.05mmol/L = 50 μmol/L; O VProduto padrão: 100 μl = 1 x 10^-4 L; múltiplo de diluição: VAntitotal ÷V Liquido líquido = (50 + 850)

+50+50+175+175）÷500=2.7； Cpr: concentração de proteína em líquido bruto (mg/ml)Necessita de medição adicional, recomendamos o uso da empresa BCAKit de teste de teor de proteína; W: qualidade da amostra, g；V Amostra: Adicionar volume de líquido de enzima grossa, 10 μl = 0,01 ml；T: Tempo de Reação Catalítica(m)in）， 30 minutos.

Kit de teste de atividade de su-N-desmetilase de mofo vermelho Série P450